Semikwantitatieve analyse van GHB met GC-FID bij

Commentaren

Transcriptie

Semikwantitatieve analyse van GHB met GC-FID bij
A
Extr ct
Semikwantitatieve analyse van GHB met
GC-FID bij gelijktijdige analyse van alcoholen
in serum
H.P. de Jong* en J.P. Yska
Hogere doseringen kunnen al snel leiden tot bewusteloosKlinisch Farmaceutisch Laboratorium
heid en ademhalingsdepressie [1,2].
Medisch Centrum Leeuwarden
Als alternatief voor GHB worden ook gamma-butyrolacton
Postbus 888, 8901 BR Leeuwarden
(GBL) en 1,4-butaandiol (BD) gebruikt (zie figuur 1 voor
H.P.
de Jong* en J.P. Yska
structuurformules).
* correspondentie
Klinisch Farmaceutisch Laboratorium
Medisch Centrum Leeuwarden
GBL en BD zijn industriële oplos- en verdunningsmiddelen
Samenvatting
Postbus
888, 8901 BR Leeuwarden
die eenvoudig verkrijgbaar zijn via het internet.
* correspondentie
In het lichaam worden GBL en BD in de lever snel gemetaGamma-hydroxyboterzuur (GHB) is een lichaamseigen stof
boliseerd tot GHB [1]. GBL wordt tevens gebruikt als gronddie tevens wordt gebruikt als partydrug. Klinische effecten
stof voor het produceren van GHB. Omdat GHB vaak zelf
van GHB en zijn chemische voorlopers GBL en BL zijn
Samenvatting
wordt gemaakt, is de ingenomen dosis meestal onduidelijk,
onder andere euforie, ontremming, ademhalingsdepressie
omdat de exacte concentratie van de oplossing niet bekend
en coma. Het klinische beeld van een GHB-intoxicatie lijkt
Gamma-hydroxyboterzuur (GHB) is een lichaamseigen stof die tevens wordt gebruikt als partydrug.
is.en
Daarnaast
de GHB
vaneuforie,
wisselende
kwaliteit zijn en
daarbij
op
een
alcoholintoxicatie.
Met
de
bestaande
GCKlinische effecten van GHB en zijn chemische voorlopers GBL
BL zijn kan
onder
andere
ontremming,
vermengd inlijkt
drankjes.
Ditop
kaneen
resulteren in ernstige
FID methode voor alcoholen
glycolen
een methode
ademhalingsdepressie
en en
coma.
Hetisklinische
beeld van eenworden
GHB-intoxicatie
daarbij
en potentieel
GHB
vergiftigingen
ontwikkeld, waarbij naast
analyse van
alcoholintoxicatie.
Met de
de kwantitatieve
bestaande GC-FID
methode voor alcoholen
endodelijke
glycolen
is een
methode[2,3].
ontwikkeld,
Op de spoedeisende
hulp (SEH)
worden regelmatig
ethanol, semikwantitatief
GHB bepaald
kan worden.
Dit
waarbij
naast de kwantitatieve
analyse
van ethanol,
semikwantitatief
GHB bepaald
kan worden.
Dit kan een
belangrijk
hulpmiddel
zijn bij
stellen
van
comateuze
patiënten.
patiënten
binnengebracht
met verschijnselen die mogelijk
kan een belangrijk
hulpmiddel
zijnhet
bij het
stellen
vaneen
eendiagnose bij
kunnen wijzen op een GHB-intoxicatie.
diagnose bij comateuze patiënten.
Het probleem hierbij is dat het klinische beeld van een GHBSleutelwoorden
intoxicatie lijkt op een alcohol-intoxicatie [4]. Indien alcohol
Sleutelwoorden
en GHB gelijktijdig worden ingenomen, wordt eerst de
GHB,
toxicologie,analyse,
analyse,GC-FID
GC-FID
alcohol in de lever omgezet door alcoholdehydrogenase; dit
GHB, alcohol,
alcohol, toxicologie,
leidt tot stapeling van GHB en toename van de toxiciteit [2].
Inleiding
Inleiding
In de praktijk kan er bij een intoxicatie op twee manieren
worden gehandeld [5].
Gamma-hydroxyboterzuur (GHB) is een lichaamseigen
Gamma-hydroxyboterzuur (GHB) is een lichaamseigen stof die in het verleden werd gebruikt als
stof die in het verleden werd gebruikt als narcosemiddel.
narcosemiddel. Tegenwoordig staat GHB bekend als partydrug en date rape drug. De belangrijkste
Tegenwoordig staat GHB bekend als partydrug en date
1. Afhankelijk van een mogelijke verdenking van overmatig
risicofactor van het gebruik van GHB is de relatief smalle therapeutische breedte. In lage doseringen geeft
rape
drug.
De
belangrijkste
risicofactor
van
het
gebruik
van
alcoholgebruik
kan de behandelend arts besluiten om eerst
GHB euforie, ontremming en het heeft een seksueel stimulerende
werking.
GHB is de
relatief smalle
therapeutische
breedte.
lage
eenen
ethanol
spiegel aan te vragen.
Alleen als de anamnese
Hogere
doseringen
kunnen
al snel leiden
totIn bewusteloosheid
ademhalingsdepressie
[1,2].
doseringen
geeftvoor
GHBGHB
euforie,
ontremming
en het heeft een
op alcohol
gebruik negatief (BD)
is en er
na 6 uur(zie
observatie
Als
alternatief
worden
ook gamma-butyrolacton
(GBL)
en 1,4-butaandiol
gebruikt
figuur
stimulerende werking.
nog geen klinische verbetering optreedt, kan de arts alsnog
1seksueel
voor structuurformules).
Figuur 1 Structuurformules van gamma-hydroxyboterzuur
(GHB),
besluiten om een GHB spiegel
tegammalaten bepalen.
butyrolacton (GBL) en 1,4-butaandiol (BD)
GHB: C4H8O3
GBL: C4H6O2
2. Ondanks de discussie over het al of niet zinvol zijn van
het bepalen van een GHB-spiegel, kan de behandelend arts
besluiten direct GHB te laten bepalen, zonder daarnaast
een ethanol spiegel aan te vragen. De reden voor de
aanvraag is dan dat de arts wil weten of het klinisch beeld
kan worden verklaard door een GHB intoxicatie.
GBL en BD zijn industriële oplos- en verdunningsmiddelen die eenvoudig verkrijgbaar
In het Medisch Centrum Leeuwarden (MCL) is in de
zijn via het internet.
BD: C H10O2
In het lichaam4 worden
GBL en BD in deafgelopen
lever snel
gemetaboliseerd
GHB
[1]. GBL
jaren
meerdere keren,tot
bij de
analyse
van
wordt tevens gebruikt als grondstof voor
het produceren
van
GHB.
Omdat
GHB vaakNadere
ethanol,
bij toeval een
GHB
intoxicatie
aangetoond.
zelf wordt
gemaakt, is de ingenomen dosis
meestal
onduidelijk,
omdat GHB
de exacte
Figuur 1 Structuurformules
van gamma-hydroxyboterkwantifi
cering met
een kwantitatieve
analysemethode
concentratie
van
de
oplossing
niet
bekend
is.
Daarnaast
kan
de
GHB
van
wisselende
kwaliteit
zijn is
enditworden
zuur (GHB), gamma-butyrolacton (GBL) en 1,4-butaan[6] moest dan nog uitsluitsel geven. Helaas
een meer
vermengd
in
drankjes.
Dit
kan
resulteren
in
ernstige
en
potentieel
dodelijke
GHB
vergiftigingen
[2,3].
diol (BD)
Op de spoedeisende hulp (SEH) worden regelmatig patiënten binnengebracht met verschijnselen die
mogelijk kunnen wijzen op een GHB-intoxicatie.
Het probleem hierbij is dat het klinische beeld van een GHB-intoxicatie lijkt op een alcohol-intoxicatie [4].
38 alcohol en GHB gelijktijdig worden ingenomen, wordt eerst de alcohol in de lever omgezet door
Indien
alcoholdehydrogenase; dit leidt tot stapeling van GHB en toename van de toxiciteit [2].
In de praktijk kan er bij een intoxicatie op twee manieren worden gehandeld [5].
1. Afhankelijk van een mogelijke verdenking van overmatig alcoholgebruik kan de behandelend arts
A
Extr ct
bewerkelijke methode en de daarvoor benodigde extra tijd is
voor de aanvrager niet wenselijk. Daarom is de mogelijkheid
onderzocht of het GHB gehalte gelijktijdig met ethanol
bepaald kan worden.
In de literatuur is reeds een soortgelijke kwalitatieve
methode beschreven [1]. Hierin staat vermeld dat door de
omzetting van GHB naar GBL in aanwezigheid van warmte
er geen directe analyse met GC mogelijk is. Kwantitatieve
analyse lijkt dus problemen te geven, maar semikwantitatief
kan er mogelijk wel een goede indicatie van het GHB
gehalte worden gegeven.
Doel
Het opstellen van een eenvoudige, snelle semikwantitatieve
analysemethode voor de bepaling van GHB in serum van
comateuze patiënten, door gebruik te maken van de GC-FID
methode voor de analyse van alcoholen en glycolen.
Methode ontwikkeling
Voor de analyse is gebruik gemaakt van een bestaande
GC methode voor de analyse van alcoholen en glycolen.
Voor het (semi)kwantificeren van GHB is een ijklijn gemaakt
en er zijn oude en nieuwe patiëntenmonsters, die ook zijn
geanalyseerd met de reeds aanwezige kwantitatieve GHB
analysemethode, gebruikt als referentiemateriaal. Daarnaast
is gebruik gemaakt van het KKGT (Kwaliteitsbewaking
Klinische Geneesmiddelanalyse en Toxicologie)
controleserum voor GHB als onafhankelijke referentie.
Op basis van de literatuur en uit eerder testen is gebleken,
dat deze nieuwe bepalingsmethode niet geschikt is voor
kwantitatieve analyse [1]. Er kan echter semikwantitatief een
goede indicatie worden gegeven van de concentratie GHB.
Ter onderbouwing van de betrouwbaarheid van de resultaten, is ervoor gekozen de methode beperkt te valideren,
waarbij de parameters: lineariteit, specificiteit, selectiviteit,
juistheid, bepalings- en detectiegrens zijn onderzocht [7].
Materialen en methoden
Reagentia
Natrium-4-hydroxybutyraat: (Bufa art.nr. 142010);
1-propanol p.a. (Merck art. nr. K1.00997);
Blanco (newborn) kalfsserum (Invitrogen life
technologies art.nr. 16010-159);
1-Butanol, spoelvloeistof GC (Lab-scan art. nr A29A11X);
KKGT controle ALCOHOLEN 2010;
KKGT controle 2010 GHB 100,1 mg/L.
Apparatuur en instellingen
Gaschromatograaf : CP 3800 Varian;
Auto injector: CP 8410 Varian;
Kolom: CP-WAX 57 CB for alcohols an glycols; WCOT fused
silica 25 m x 0.53 mm x 0.50 µm, catno. 7617 (Varian);
Injector Temperatuur: 220 0C;
Kolom flow: 10 mL/min (Electronic Flow Control);
Detector FID temperatuur: 220 0C;
Dragergas: Helium;
Injectievolume 1 µL;
Split ratio: 10;
Kolom Oven: 45 0C(0,75min) -> 180 0C, 20 0C/min (totaal
7,5 min);
Runtijd 7,5 min.
Voor het ‘smeren’ van de injectiespuit van de GC wordt als
spoelvloeistof onder andere 1-butanol gebruikt.
Butanol geeft in het chromatogram een ‘spoelpiek’ op
Rt = 2,4 min.
Oplossingen en monstervoorbewerking
Interne standaard (I.S.):
Stockoplossing I.S. 1-propanol (1000 mg/L):
Weeg 100 mg 1-propanol af in een maatkolf van 100 mL en
vul aan met water.
Werkoplossing I.S. 1-propanol (100 mg/L) :
Pipetteer 100 µL stockoplossing in een maatkolf van 100 mL
en vul aan met water.
GHB stockoplossing ijklijn
Stockoplossing GHB:
Weeg 1211 mg Na-4-hydroxybutyraat af in een maatkolf van
100 mL en vul aan met water tot de maatstreep en meng. Dit
komt overeen met 10.000 mg/L GHB.
Molmassa Na-4-hydroxybutyraat 129,09 g/mol
Molmassa gamma-hydroxyboterzuur 104,10 g/mol
IJkreeks
Reeks 1: Pipetteer uit de stockoplossing GHB achtereenvolgens in duplo: 0; 0,250 mL; 0,500 mL; 1,00 mL; 2,00 mL
en 5,00 mL in een maatkolf van 10 mL. Vul aan met water tot
de maatstreep en meng.
Reeks 2: Verdun reeks 1 door van elke verdunning 1,00 mL
te pipetteren in maatkolven van 10 mL. Vul aan met blanco
kalfsserum tot de maatstreep en meng.
Pipetteer achtereenvolgens in autosampler vials, 1000 µL
werkoplossing I.S. 1-propanol en uit elke maatkolf 200 µL
van reeks 2. Vortex 5 sec.
Serummonsters
Pipetteer in een autosampler vial: 1000 µL werkoplossing
I.S. 1-propanol + 200 µL serum. Vortex 5 sec.
39
met blanco kalfsserum tot de maatstreep en meng.
KKGT controle 2010
GHB.
De concentraties
zijn berekend
aan
de ha
semikwantitatief
GHB
is bepaald.
De resultaten
beide
method
gepaarde
T-Toets.
In Excel
isdedubbelzijdig
met eenvan
betrouwbaarheids
Pipetteer achtereenvolgens in autosampler vials, 1000 µL werkoplossing
I.S.
1-propanol
en
uit
elke
maatkolf
Ten
slotte
kan
op
basis
van
gevonden
resultaten
een
conclusie
w
gepaarde T-Toets.
In Excel is dubbelzijdig
met een
betrouwbaarhe
hypothese
wordt geaccepteerd
( H0: beide groepen
metingen
zijn ge
200 µL van reeks 2. Vortex 5 sec.
detectiegrens.
hypothese
wordt geaccepteerd
( H0: beide
groepen
metingen
zijn
Naast
de patiëntenmonsters
is uitgevoerd
gebruik
gemaakt
van en
een
onafhankeli
De validatieberekeningen
zijn
met Excel
Regres
[7,8,9
Naast
de patiëntenmonsters
is gebruik gemaakt
van een
onafhank
KKGT
controle
2010 GHB. De concentraties
zijn berekend
aan
de han
KKGT
controle
2010
GHB.
zijn berekend
aan dewo
h
Ten
slotte
kan op
basis
van De
de concentraties
gevonden resultaten
een conclusie
Serummonsters
Ten slotte kan op basis van de gevonden resultaten een conclusie
detectiegrens.
Resultaten
en Discussie
detectiegrens.
De
validatieberekeningen zijn uitgevoerd met Excel en Regres [7,8,9
Pipetteer in een autosampler vial: 1000 µL werkoplossing I.S.
+ 200 µL serum.
Vortex 5 sec.
De 1-propanol
validatieberekeningen
zijn uitgevoerd
met Excel en Regres [7,8
Methodeontwikkeling
direct op de kolom geïnjecteerd. In geval van een GHB
Validatie
intoxicatie wordt en
met Discussie
deze analysemethode een duidelijke
Resultaten
De analyse betreft een bepalingsmethode in serum. De serummonst
Validatie
IJklijn
piek in het chromatogram
waargenomen.
Resultaten
en
Discussie
voorbewerking, afgezien van toevoeging van 1000 µL interne standa
Ter
illustratie
wordt
in
figuur
2 een wordt
voorbeeld
Methodeontwikkeling
De
lineariteit
van
de
analysemethode
is
bepaald
door
op
1
geval van een GHB intoxicatie
metchromatogram
deze analysemethode een
IJklijn
Methodeontwikkeling
getoond van een patiëntenmonster met een GHB
dag, 5 verschillende concentraties van de werkzame stof in
waargenomen.
De
analyse
betreft
bepalingsmethode
in serum.
De serummonst
intoxicatie.
Ter
illustratie
wordteen
in
figuur
2 een van
voorbeeld
chromatogram
getoon
duplo
te analyseren
metanalysemethode
als matrix blanco kalfsserum.
De
lineariteit
van de
is bepaaldHet
door op 1 dag,
5 verschillende
concentraties
de
voorbewerking,
afgezien
van
toevoeging
van
1000
µL
interne
standa
De
analyse
betreft
een
bepalingsmethode
in
serum.
De serummon
GHB
intoxicatie.
bereik van deze
gebaseerd
op referentiewaarden
werkzame
stof methode
in duploiste
analyseren
met als matrix blancogeval
kalfsserum.
Het
bereik
van
deze
methode
is
intoxicatie
met deze
50,00 van een GHB
voorbewerking,
afgezien
van wordt
toevoeging
van analysemethode
1000 µL interne een
stan
gebaseerd
op referentiewaarden
in tabel 1 [5].
van GHB, zoals
aangegeven in tabel 1van
[5]. GHB, zoals aangegeven
waargenomen.
geval van een GHB intoxicatie wordt met deze analysemethode ee
Ter
illustratie wordt in figuur 2 een voorbeeld chromatogram getoond
waargenomen.
40,00
Conc. in
GHB
intoxicatie.
Ter
illustratie
wordt in figuur 2 een voorbeeld chromatogram geto
Conc. in
50,00
serum/plasm
GHB intoxicatie.
serum/plasma
klinische
beeld
30,00
a
klinische beeld
50,00
40,00
< 50 mg/L
wakker
20,00
slaap, af en toe openen van ogen
40,00
50 - 150 mg/L
en spontane bewegingen
30,00
150 - 250 mg/L coma, reageert op knijpen
10,00
30,00
diep coma, niet reageren op
20,00
> 250 mg/L
pijnprikkels
0,00
20,00
Tabel
1
Referentiewaarden
GHB
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Tabel 1 Referentiewaarden GHB
10,000,00
Minutes
Figuur 2 Ch
Voor de specificiteit zijn 6 onafhankelijke blanco matrices opgewerkt
als serummonster. Dit om te kijken in
10,00
GHB
0,00
hoeverre
stoorpieken
vals positieve
uitslag
voor GHB geven.
Als matrix is gebruik gemaakt van blanco
Voor de specificiteit
zijn 6een
onafhankelijke
blanco
matrices
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
kalfsserum.
Lineariteit
opgewerkt als serummonster. Dit om te kijken in hoeverre
Minutes
0,00
Figuur 2 Ch
stoorpieken een vals positieve uitslag voor GHB geven.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
GHB
▲Figuur
2
Chromatogram
patiënt
GHB
±
165
mg/L
GHB
In
tabel
2
staan
de
niveaus
weergegeven
die
zijn
gebruikt
voor de ij
Minutes
Als matrix is gebruik gemaakt van blanco kalfsserum.
Figuur
2
42
GHB
De selectiviteit is aangetoond door het KKGT controleserum
Lineariteit
Validatie
Lineariteit
alcoholen 2010 te spiken met GHB om te kijken hoe GHB
niveaus
Concentratie GHB
Lineariteit
In
tabel 2 staan de niveaus weergegeven die zijn gebruikt voor de ijk
zich verhoudt tot de andere alcoholen en glycolen.
mg/L
In tabel 2 staan de niveaus weergegeven
die zijn gebruikt
De juistheid is verkregen door oude patiëntenmonsters te
LLQ
voor
de ijklijn
[7]. de niveaus 25,77
In
tabel
2 staan
weergegeven die zijn gebruikt voor de
Validatie
gebruiken, waarin direct na afname, met een kwantitatieve
51,55 GHB
niveausX1
Concentratie
GHB analysemethode, GHB is aangetoond. Deze monsters
◄Tabel 2
X2
103,1
mg/L
Validatie
zijn vervolgens ingevroren en naderhand gebruikt voor de
X3
206,19
niveaus
Concentratie
GHB niveaus
LLQ
25,77
ijklijn
validatie van de semikwantitatieve analysemethode voor
mg/L
HLQ
515,48
X1
51,55
GHB. Daarnaast zijn er twee patiëntenmonsters gebruikt,
Tabel 2 LLQ
niveaus ijklijn
25,77
X2
103,1
waarin na afname, op dezelfde dag, zowel kwantitatief als
X1
51,55
X3
206,19
semikwantitatief GHB is bepaald. De resultaten van beide
Hiermee is een ijklijn gemaakt zoals weergegeven in figuur 3.
X2
103,1
HLQ
515,48
methodes zijn vergeleken met behulp van de gepaarde
Tabel 2 niveaus
ijklijn
X3
206,19
T-Toets. In Excel is dubbelzijdig met een betrouwbaarheidsHLQ
515,48
interval van α=0,05 gekeken of de H0 hypothese wordt geHiermee
isniveaus
een ijklijn
gemaakt zoals weergegeven in figuur 3.
Tabel
2
ijklijn
accepteerd ( H0: beide groepen metingen zijn gelijk indien
Hiermee is een ijklijn gemaakt zoals weergegeven in figuur 3.
p>α).
Hiermee is een ijklijn gemaakt zoals weergegeven in figuur 3.
Naast de patiëntenmonsters is gebruik gemaakt van een
Calibratielijn GHB semi-kwantitatief
onafhankelijk referentiemonster van de KKGT: KKGT
controle 2010 GHB. De concentraties zijn berekend aan de
0,25
hand van de eerder genoemde ijklijn.
y = 0,00041x + 0,00403
0,2
Ten slotte kan op basis van de gevonden resultaten een
R = 0,99821
conclusie worden getrokken over bepaling- en detectiegrens.
0,15
De validatieberekeningen zijn uitgevoerd met Excel en
Regres [7,8,9].
A
GHB - 5,333 GHB - 5,333
GHB - 5,333
mV
mV
mV
IS n-propanol -IS1,735
n-propanol - 1,735
IS n-propanol - 1,735
spoelvl butanolspoelvl
- 2,401butanol - 2,401
spoelvl butanol - 2,401
Extr ct
Height ratio
2
Resultaten en Discussie
Methodeontwikkeling
De analyse betreft een bepalingsmethode in serum. De
serummonsters worden zonder verdere voorbewerking,
afgezien van toevoeging van 1000 µL interne standaard,
0,1
0,05
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
gehalte mg/L
Figuur
IJklijnGHB
GHBsemikwantitatief
semikwantitatief
▲Figuur3
3 IJklijn
De lineariteit is getest met ANOVA. De resultaten staan samen
Parameter
40
As afsnede
Correlatiecoëfficiënt
Goodness of fit
Lack of Fit
GHB semikwantitatief
geen significante
afwijking t.o.v. "0"
0,99916
significatie GOF
geen LOF
0,05
A
Extr ct
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
gehalte mg/L
Figuur 3 IJklijn GHB semikwantitatief
Juistheid
De lineariteit is getest met ANOVA. De resultaten staan
Juistheid in tabel 3.
De
lineariteit
is getest
met ANOVA. De resultaten staan samengevat
samengevat
in tabel
3.
Parameter
GHB semikwantitatief
geen significante
As afsnede
afwijking t.o.v. "0"
Correlatiecoëfficiënt
0,99916
Goodness of fit
significatie GOF
Lack of Fit
geen LOF
willekeurig verdeeld om
Residuplot
nul
▲Tabel33Samenvatting
Samenvatting resultaten
Tabel
resultatenlineariteit
lineariteit
De resultaten van de patiëntenmonsters staan samengevat
De
resultaten
van de patiëntenmonsters staan samengevat in tabe
in tabel
4.
2,399
3,00
-1,00
-1,50
4,60
4,80
5,00
5,20
3,00
5,40
5,60
Minutes
trichloorethanol - 5,707
mV
0,00
-0,50
1,135
1,268
GHB
- 5,325 1,736- 5,366
ethyleenglycol
GHB - 5,325
mV
1,00
5,80
6,00
2 ,3 9 9
1,50
6,20
6,40
5,3255,366
5,707
2,00
trichloorethanol - 5,707
ethyleenglycol - 5,366
2,50
0,50
2,50
2,00
ethyleenglycol - 5,366
butanol spoelvloeistof - 2,399
ethanol - 1,268
methanol - 1,135
I.S. 1-propanol - 1,736
butanol spoelvloeistof - 2,399
Semikwantitatief
duplo
Recovery %
mg/L
gem.
to.v.
mg/L
1
2
mg/L kwantitatief
209
221
215
190
113
190
172
181
165
109
238
249
243
214
114
257
261
259
228
114
Juistheid
335
363
349
324
108
Specificiteit
Specificiteit
De resultaten
van
staan
502de patiëntenmonsters
470
486
426
114 samengevat in ta
169
199
184
188
98
Door injectie
van
nietniet
voorbewerkte
serummonsters
treedt
Door
injectie
van
voorbewerkte
serummonsters
treedt vervuiling op van de kolom. Dit kan veel ruis en
Kwantitatief
Semikwantitatief
282*
328*
305
281*
109
vervuiling op van
de kolom.
kan veel ruis
en stoorpieken
stoorpieken
geven.
DezeDitvervuiling
wordt
zoveel mogelijk weggevangen door de liner. Regelmatig uitstoken
Recovery
%
171* duplo
150*
161
153* te voorkomen.
105
geven.
vervuiling
wordt van
zoveel
weggevangen
van
deDeze
GC en
vervangen
demogelijk
liner helpt
dit probleem grotendeels
Een ethanolbepaling
mg/L
gem.
to.v.
Tabel
4
Resultaten
vergelijking
patiëntenmonsters
kwantitatief
v
▲Tabel 4 maar
Resultaten
vergelijking
door de
liner.spiegels,
Regelmatigdie
uitstoken
dezal
GChebben
en vervangen
geeft
hoge
weinigvan
last
van deze vervuiling,
GHB kan
hier welpatiëntenmonsters
wat hinder van
mg/L vs. semikwantitatief
1
2
mg/L kwantitatief
dag)
kwantitatief
(*analyse
op
dezelfde
van de liner helpt
dit probleem
grotendeels te<voorkomen.
ondervinden,
vooral
bij concentraties
50 mg/L. Praktisch zal dit echter weinig problemen geven, omdat
209
221
215
113
dag) 190
alleen
een spiegel geeft
met hoge
een concentratie
van >
Een ethanolbepaling
spiegels, die weinig
last50
zalmg/L een arts relevante informatie geeft (zie tabel 1).
Statistische
van
beide 181
methodes met
190
172
165 vergelijking
109behulp van de ge
Daarnaast
is bijvervuiling,
injectie van
blanco
(kalfsserum) gebleken dat bij het juist instellen van de
hebben van deze
maar6GHB
kan matrices
hier wel wat
Ondanks
dat p< α238
(0,05) is,
vinden243
wij de resultaten
acceptabel vo
249
214
minimum
height de eventuele
vervuiling geen
vals positieve
GHB spiegels
geeft.
Zie
tevens
detectie
en114
hinder van ondervinden,
vooral bij concentraties
< 50 mg/L.
Statistische
vergelijking
van
beide
methodes
met
behulp
gemiddelde
recoveries
van
de
geteste
monsters
liggen,
ten opzicht
257
261
259
228
114
bepalinggrens.
Praktisch zal dit echter weinig problemen geven, omdat
van de de
gepaarde
levert
op datmarge
p= 0,0037.
Ondanks
binnen
+/-15T-toets
%.
Als
‘veilige’
houden
wij
hiervoor
+/- 20
335
363
349
324
108
alleen een spiegel met een concentratie van > 50 mg/L een
Het
tussen
de duplo
bepaling acceptabel
van de semikwantitatieve
an
dat verschil
p< α (0,05)
is, vinden
wij de resultaten
voor
502
486aanwijsbaar,
426
114 mogelijk dat sp
Selectiviteit
arts relevante informatie geeft (zie tabel 1). Daarnaast is bij
oorzaak
voor dit verschil
is470
niet
een semikwantitatieve
bepaling.
De direct
gemiddelde
recoveries
169 liggen,
184
188
98
De
2 resultaten
uit 199
deten
tabel
zijn van
patiëntenmonsters
wel
injectie van 6 blanco matrices (kalfsserum) gebleken dat
vanlaatste
de
geteste
monsters
opzichte
van de
kwanUit
hetjuist
chromatogram
figuur 4
blijktdedat
GHB (Rt 5.325zijn
min)
en Ethyleenglycol
(Rt
5.366
min),demet
een
282*
328*
305
gemeten.
Hiermee
is
onder
andere
invloed
van
het
invrieze
281*
109
bij het
instellen van deinminimum
height
eventuele
titatieve analysemethode, binnen de +/-15 %. Als ‘veilige’
resolutie
(Rs) vals
van positieve
1, niet basislijn
zijn geeft.
gescheiden.
Voor devoor
kwantificering
(height)
levert ditOp
geen
problemen
deze
validatie
zijn gebruikt.
grond
van
de gevonden recov
161
153*
105
vervuiling geen
GHB spiegels
Zie tevens
marge
houden wij 171*
hiervoor +/-150*
20 % aan.
monsters
weinig
invloed te
zijn op het GHB gehalte.
op
en de
kans
deze samen in een patiëntenmonster aan tedeze
treffen
isResultaten
erg van
klein.
Tabel
4
vergelijking
patiëntenmonsters
kwantitatief
detectie
en
bepalinggrens.
Het verschil tussen de duplo bepaling van de semikwanti50,00
50,00
dag)
is max. 15van
%. het
Eenonafhankelijk
oorzaak voor KKGT controle
45,00
45,00
Intatieve
tabelanalysemethode
5 staan de resultaten
dit
verschil
is
niet
direct
aanwijsbaar,
mogelijk
dat spikes van
40,00
40,00
Selectiviteit
Statistische vergelijking van beide methodes met behulp van de
invloed zijn.
35,00
35,00
Ondanks dat p< α (0,05) is, vinden
wij de resultaten acceptabel
Semikwantitatief
Uit het chromatogram in figuur 4 blijkt dat GHB (Rt 5.325
De laatste 2 resultaten uit de tabel zijn van patiëntenGehalte
gemiddelde
recoveries van de geteste monsters liggen, ten opzic
30,00
30,00
min) en Ethyleenglycol (Rt 5.366 min), met een resolutie (Rs)
monstersde
welke
opGehalte
dezelfde
dag metduplo
beide
methodes
zijn
volgens
binnen
+/-15
%. Als ‘veilige’
marge
houden
wij hiervoor +/00
van25,00
1, niet basislijn zijn gescheiden. 25,Voor
de kwantificering
gemeten.
Hiermee
is
onder
andere
de
invloed
van
het
KKGT
kwantitatief
1
2
gem
Het verschil tussen de duplo bepaling van de semikwantitatieve
20,00
(height)
levert dit geen problemen op20,00 en de kans deze samen
invriezen voor
op de dit
patiënten
monsters
bepaald,
voor deze mogelijk dat
92
89 die
oorzaak
verschil
is niet
direct
aanwijsbaar,
100,1
in een
is erg klein.
15,00
15,00 patiëntenmonster aan te treffen
87,9Op
mg/L
mg/
mg/
90recoveries
mg/L
validatie
zijn 2gebruikt.
grond
van
de gevonden
De
laatste
resultaten
uit
de
tabel
zijn
van
patiëntenmonsters
w
mg/L
L andere
L devan
10,00
10,00
lijkt het
vriezen en
ontdooien
deze
monsters
weinig van het invrie
zijn
gemeten.
Hiermee
isvan
onder
invloed
50,00
50,00
Recovery
invloed
te zijn
op het GHB
voor
deze
validatie
zijngehalte.
gebruikt. Op grond van de gevonden rec
5,00
5,00
t.o.v.
45,00
deze
monsters van
invloed te zijn 90,1
op het
45,00
87,8weinig
%
%GHB gehalte.
0,00
0,00
gedeclaree
0,00 5,00
1,00
2,00
3,00 6,004,00
5,00
6,00
7,00
In tabel 5 staan de resultaten van het onafhankelijk KKGT
1,00
2,00
3,00
4,00
7,00
40,00
40,00 0,00
Minutes
Minutes
rd. 5 staan de resultaten van het onafhankelijk KKGT contro
In
tabel
controle
serum.
35,00
35,00
Tabel 5 Resultaten kwantitatieve en semikwantitatieve analyse va
mV
Kwantitatief
1,50
4,60
4,80
5,00
5,20
+ KKGT controle 2010 GHB 100,1 mg/L.
5,40
5,60
Minutes
5,80
6,00
6,20
6,40
5 ,5 3, 23 56 6
5 ,7 0 7
-1,00
-1,50
trichloorethanol - 5,707
0,00
-0,50
trichloorethanol - 5,707
0,50
1 ,1 3 5
1 ,2 6 8
GHB
- 5,325
ethyleenglycol
1-, 5,366
736
GHB - 5,325
mV
1,00
m V
I.S. 1-propanol - 1,736
ethanol - 1,268
methanol - 1,135
mV
Figuur 4 Chromatogram KKGT controle Alcoholen 2010 + KKGT controle 2010 GHB 100,1 mg/L.
30,00
30,00
Semikwantitatief
De afwijking tussen de beide bepalingsmethodes
is voor het KKGT
25,00
25,00
Gehalte
duplo
volgens
Gehalte
20,00
20,00
KKGT
kwantitatief
1
2
gem
15,00
15,00
92
89
Detectie100,1en bepalingsgrens
10,00
10,00
87,9 mg/L
mg/ mg/ 90 mg/L
mg/L
44
L alleen
L proefondervindelijk vast
5,00
5,00
De detectie- en bepalingsgrens zijn
Recovery
mg/L
voor een arts niet klinisch relevant is (tabel 1), is besloten de
0,00
0,00
t.o.v.
mg/L.
Concentraties
lager
dan
0,00 5,00
1,00
2,00
3,00 6,004,00
5,00
6,00
7,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
7,00
87,8
% dan 50 mg/L worden
90,1
%ook gerapport
Minutes
Minutes
gedeclaree niet aantoonbaar zijn. De LLQ in de ijklijn is 25 mg/L
ogenschijnlijk
rd.
Tabel
kwantitatieveenen
semikwantitatieve analyse
Discussie
▲Figuur 4 Chromatogram KKGT controle Alcoholen 2010
▲Tabel55Resultaten
Resultaten kwantitatieve
semikwantitatieve
analyse van GHB in ‘KKGT controle 2010 GHB’.
De afwijking tussen de beide bepalingsmethodes is voor het KKG
Detectie- en bepalingsgrens
41
De detectie- en bepalingsgrens zijn alleen proefondervindelijk va
mg/L voor een arts niet klinisch relevant is (tabel 1), is besloten
mg/L. Concentraties lager dan 50 mg/L worden dan ook gerappo
ogenschijnlijk niet aantoonbaar zijn. De LLQ in de ijklijn is 25 mg
A
Extr ct
Detectie- en bepalingsgrens
De detectie- en bepalingsgrens zijn alleen proefondervindelijk
vastgesteld. Omdat een uitslag van GHB < 50 mg/L voor een
arts niet klinisch relevant is (tabel 1), is besloten de bepalings
grens vast te stellen op 50 mg/L. Concentraties lager dan 50
mg/L worden dan ook gerapporteerd als GHB: < 50 mg/L,
ook als deze ogenschijnlijk niet aantoonbaar zijn. De LLQ in
de ijklijn is 25 mg/L en wordt aangehouden als detectiegrens.
Discussie
Met de ontwikkelde methode wordt een indicatie gegeven
van het GHB-gehalte in serum/plasma.
Bij deze methode is niet specifiek gekeken naar het verschil
tussen plasma en serum. De analyse is, al naar gelang wat
geprikt was, uitgevoerd op zowel serum- als plasmamonsters.
Er wordt nadrukkelijk geen kwantitatieve uitslag gegeven
maar een semikwantitatief resultaat.
In de praktijk is het in veel gevallen voldoende te weten
of er sprake is geweest van GHB gebruik en is het exacte
resultaat minder van belang. Mocht er sprake zijn van een
GHB intoxicatie dan wordt over het algemeen symptomatisch
behandeld en volgt herstel vaak 2-6 uur na inname [5].
Bij de uitslag wordt vermeld dat het een semikwantitatieve
bepalingsmethode betreft. Bij twijfel, zowel van de aanvrager
als de analist, moet altijd worden uitgeweken naar de
kwantitatieve GHB analysemethode.
Met deze methode kan geen onderscheid worden gemaakt
tussen GHB en GBL. GBL geeft met deze methode in het
chromatogram een piek met dezelfde retentietijd. Daarom
is deze methode alleen geschikt voor analyse in serum of
plasma en niet in oplossingen. Eventueel kan deze methode
wel voor kwalificatie in urine worden gebruikt. GHB is in urine
tot 8 uur na inname aantoonbaar. In serum is detectie alleen
mogelijk bij bloedafname binnen 4-6 uren na inname [2,5].
Voor de analyse van alle drie componenten afzonderlijk,
GHB, GBL en BD, is het verstandig voor een LC/MS
methode of alternatief te kiezen.
Gezien het groeiende GHB probleem is er behoefte aan een
snelle GHB bepaling. Inmiddels is een eenvoudige kwantitatieve enzymatisch test beschreven voor GHB in bloed en
urine [10]. Deze test heeft echter als beperking dat ethanol
de test kan storen.
ethanol, heeft gebruikt. Dit kan een belangrijk hulpmiddel zijn
voor het stellen van een diagnose bij comateuze patiënten.
Gebaseerd op onderzoek van H.P. de Jong in het kader van
haar opleiding tot Specialist Klinische-Farmaceutische en
-Toxicologische Analyse.
References
1
Lundquist P, “Analysis of γ-hydroxybutyraat (GHB)
and γ-butyrolactone (GBL) in liquids performed at
national laboratory of forensic science (SKL),
Sweden.” Problems of Forensic Science, 2001;
vol. XLVII: 345-357
2
Veerman SRT, Dijkstra HN, Lieftins-Kluft I,
“Levensbedreigende onhoudingsverschijnselen door
gammahydroxyboterzuur.” Tijdschrift voor psychiatrie,
2010; 52: 6
3
Elliott S, Burgess V, “The presence of gamma-hydroxybutyric acid and gamma butyrolaconte in alcoholic
an non- alcoholic beverages.” Forensic Science
International, 2005; 151: 289-292
4 Kramers C, “ Party drugs: gammahydroxyboterzuur
(GHB).” Geneesmiddelenbuletin nr. 4-01 mei 2006,
48-49
5
Grouls RJE, Bindels AJGH, Roos A and Keizer K,
Gamma-hyroxy-boterzuur (GHB). Available from
URL: http://www.toxicologie.org/monografieen/
frametox.asp?ID=32, geraadpleegd 03-10-2011
6 Van ‘t Veer NE and Lameijer W, Bepaling in serum
Gammahydroxyboterzuur. Pharm Weekbl 2001;
136:104-5
7 Dictaat “Validatie van Bioassays”
Onderdeel HBO opleiding specialist klinisch farmaceutisch en toxicologisch analyse, 2004
8 Andries JPM, Vries AB de, “Chemometrie” 2de druk,
Bohn Stafleu van Lochum, Houten/Diegem, 2001
Conclusie
9 Klaessens JWA, “Statistiek in het laboratorium met
EXCEL”, Syntax Media, Arnhem, 2009:52-55
Een praktische GC-FID methode is ontwikkeld voor de semikwantitatieve analyse van GHB, gelijktijdig met de kwantitatieve analyse van ethanol. Door gebruik te maken van de
GC-FID methode voor alcoholen en glycolen, worden ook
andere alcoholen, indien aanwezig, direct meebepaald.
Hiermee kan snel uitsluitsel worden gegeven, of een comateuze patiënt wel of niet GHB, eventueel in combinatie met
10 Hasan L, Jermann TM, Weber JM, Abrahamsso L,
Schiotti M-A, Böttcher M, Jöchle W, Gygaz D,
Scholer A, “An Enzymatic Method to Determine
γ –Hydroxybutyric Acid in Serum and Urine.
”Ther Drug Monit, 2011; 33: 757–765
42